Для определения противоопухолевого влияния экстрактов были использованы следующие линии: клетки меланомы мыши (B16F10), клетки рака молочной железы (MCF7), в качестве нормальных клеток использовались мезенхимальные клетки выделенные из костного мозга крыс.
Клеточная линия меланомы была выбрана, поскольку будет использована в эксперименте in vivo по определению влияния «Идеальная Я» на развитие опухоли и на выживаемость животных опухоленосителей.
Линия клеток MCF7 была использована, поскольку является общепринятой линией для исследования действия различных соединений и препаратов на развитие опухоли молочной железы.
Мезенхимальные клетки костного мозга (МСК) являются нормальными стромальными клетками организма, способные дифференцироваться в зрелые клетки жировой, костной ткани, а также в кардиомициты и нервные клетки. МСК используются в качестве нормальных клеток для сравнения с опухолевыми клетками, поскольку имеют высокий пролиферативный потенциал, сохраняя свои функциональные свойства.
В работе использовали фильтраты экстрактов 445 и 220 нм в диапазоне концентраций от 5,4-0,005 мг/мл.
Для определения влияния экстрактов на жизнеспособности клеток использовали МТТ – тест, который основан на способности фермента сукцинатдегидрогеназы митохондриальной мембраны клеток млекопитающих восстанавливать соль (4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5димфенилтетразолия бромид (Sigma-Aldrich, США) до кристаллов формазана. Интенсивность накопления кристаллов формазана свидетельствует об уровне митохондриального дыхания клетки (метаболическую активность), что является показателем ее жизнеспособности. Время эксперимента составляло 48 часов. Оценку результатов теста проводили путем сопоставления оптической плотности растворенного формазана контрольных образцов (приняты за 100%) к опытным. Оптическую плотность растворов измеряли при длине волны 620 нм, используя планшетный спектрофотометр Multiskan FC (ThermoScientific, USA).
В результате экспериментов было показано, что экстракт «Идеальная Я» в диапазоне концентрации 5,4-0,34 мг/мл сухого вещества вызывал снижение жизнеспособности клеток меланомы на 42% (220 нм) и 22% (445 нм). Концентрации от 0,34 мг/мл до 0,085 мг/мл одинаково снижали жизнеспособность на 15% в опытных образцах фильтратов 220 нм и 445 нм. Дальнейшее разведение экстрактов не влияло на жизнеспособность опухолевых клеток. ( Рис. 1).
Рисунок 1. Влияние экстрактов «Идеальная Я» на жизнеспособность клеток меланомы B16F10.
Оценка влияния экстрактов на жизнеспособность и пролиферативный потенциал клеток рака молочной железы определяли при помощи кинетического анализатора xСelligence. Принцип данного метода основан на чувствительности микроэлектронных биосенсоров, которые позволяют динамически и в реальном времени анализировать клеточное поведение. Для данного метода используются специальные планшеты, покрытые золотыми электродами. При прикреплении клеток ко дну планшета происходит изменение электрического сопротивления и соответственно чем выше сопротивление, тем больше клеток прикреплено ко дну лунки. Значение сопротивления, считываемое с электродов, отражает изменения количества распластанных (живых) клеток. При апоптозе/некрозе клеток происходит округление клеток и открепление их от дна, что регистрируется прибором и отражается в виде падения сопротивления (рис.2).
Клетки MCF7 (рак молочной железы) рассаживались в лунки по 5*103 клеток/лунка, после прикрепления клеток к ним добавляли экстракты: фильтрат Т.О. 220 нм в концентрациях 0,34 и 0,042 мг/мл. Также в данном эксперименте был исследован экстракт «Идеальная Я», содержащий растительный компонент. Растительный компонент был предварительно крупно измельчена, далее в условиях заморозки жидким азотом растительный компонент растирали до более мелких частиц. Соотношение «Идеальная Я» к навеске растительного компонента составляло 5/1. Полученные навески перетирались, экстракцию проводили аналогично предыдущим экспериментам.
В результате эксперимента показано, что концентрация 0,34 мг/мл экстракта «Идеальная Я» и «Идеальная Я + растительный компонент» является токсичной для клеток рака молочной железы, клетки погибли в течении 48 часов. Концентрация экстрактов 0,042 мг/мл в первые 48 часов не влияла на жизнеспособность клеток, кривые совпадали с кривыми контрольных клеток. Однако на 3-4 сутки клетки, обработанные экстрактом Идеальная Я + растительный компонент погибли. В лунках, обработанных Идеальная Я в низких концентрациях на 3-4 сутки шло торможение пролиферации, однако в последующем наблюдался рост пролиферативной активности, приближающейся к контрольным (рис.2).
Рисунок 2. Влияние экстрактов Идеальная Я/ Идеальная Я.+ растительный компонент на жизнеспособность клеток рака молочной железы (MCF7).
Таким образом, было показано, что экстракты в концентрации 0,34 мг/мл оказывают значительную ингибирующую активность по отношению к клеткам рака молочной железы. При уменьшении концентрации эффекта на жизнеспособность клеток не отмечается. Однако добавление растительного компонента к Идеальная Я значительно усиливает ингибирующий эффект экстрактов на клетки рака молочной железы.
При оценке влияния экстрактов на МСК было показано, что концентрация 5,4 мг/мл вызывала незначительный ингибирующий эффект на жизнеспособность клеток (снижение на 15%). Скорее всего, это связано с ингибированием пролиферации, поскольку морфология клеток не была изменена. Остальные концентрации экстрактов не влияли на жизнеспособность клеток.
Итак, в результате оценки влияния экстрактов Идеальная Я на жизнеспособность клеток различных линий, была показана более высокая ингибирующая активность на клетки опухолевых линий по сравнению с нормальными клетками организма.
Данные результаты являются предварительными.
р
